本公司慢病毒包装采用的载体属于“第三代”慢病毒载体，其基因组的3’ LTR的增强子功能发生了缺失，从而形成了所谓的“自灭活”（Self-inactivation，SIN），即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有较好的安全性。病毒的包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多种细胞（包括分裂和非分裂细胞），且病毒更趋稳定。

载体选择见下表：

说明：在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，我们通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转染效率，以达到目的基因的表达。并为活体动物模型实验提供高浓度的包含目的基因的病毒液。

服务流程

²   根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；

²   对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；

²   使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293TN 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

²   浓缩、纯化病毒液；

²   用高质量的病毒液感染HT1080细胞；

²   通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）。

腺病毒（Adenovirus，AdV）由于其宿主范围广、转染效率高、表达强度强的显著优点成为目前运用最普遍的病毒载体之一。本公司在Adeasy、AdMax等腺病毒系统的基础上，经过不断的改进与优化，积累了丰富的经验，建立了一套成熟的腺病毒包装系统。本系统是以复制缺陷型腺病毒DNA为骨架构建成的重组腺病毒系统，在穿梭载体、病毒骨架载体及包装细胞系等方面有很大优势，出毒快捷、滴度高、包装可靠！

技术特点

²   载体构建周期短，重组腺病毒载体克隆阳性率高，高达95%以上；

²   完整的穿梭载体系统（部分载体如下表），能够满足各种实验要求；

²   包装成功率达到100%，主要基于对包装细胞系的改造及基因在包装细胞系的受控表达，其他腺病毒包装系统远远达不到这样的包装成功率；

²   病毒滴度高，纯化后可以达到3×10¹¹ - 5×10¹¹ pfu/ml，体积在2ml左右。

部分穿梭质粒列表

毅新兴业目前可为研究者提供rAAV2和rAAV2/1两种腺相关病毒载体的包装服务，包括从实验设计到载体包装、生产纯化、质量检定等一系列服务，能够为从事基础研究、药物临床前研究和早期临床研究的研究者提供高纯度、高滴度的腺相关病毒载体产品。

问：HIV-1载体系统由哪些部分组成，在利用该系统进行病毒包装是应注意什么？

答：HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。

问：常用腺病毒载体的包装方法有哪些？

答：常用的有以下3种：

    经典的同源重组法（双质粒共转染）：原理是同源重组。在腺病毒左臂区域（通常缺失E1基因区）插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组（通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。主要缺点是重组效率比较低。

    Ad-Easy法：原理是通过同源臂重组的方式在细菌中获得重组腺病毒基因组质粒。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的质粒共转化RecA+细菌，在细菌RecA重组酶的作用下经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其线性化后转染293细胞获得重组病毒。

    AdMax包装系统：通过Cre/loxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。这个系统有多种优势，包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于10⁴vp/cell）、目的基因的表达水平高（因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍）等。

鉴于此，本公司推荐用AdMax包装系统制备腺病毒载体。

问：在进行腺相关病毒包装时，5种血清型AVV载体具有什么样的特色？

答：各种血清型AAV载体在小鼠肝脏和肌肉组织中感染效率由高到低的顺序是1>5>3>2>4；在大鼠视网膜中顺序是5>4>1>2>3。其中AAV1和AAV5载体有很好的应用前景。与AAV2载体相比，AAV1载体在除神经组织外的其他组织，比如肌肉组织和肝脏中的转导效率都普遍较高。其中AAV1对免疫缺陷小鼠的骨骼肌的感染效率比AAV2高出100-1000倍；AAV5载体在视网膜、大脑和胰岛中表现出更好的感染效率。
    目前各种血清型AAV载体的通常是“杂合”载体(AAV5除外)，即使用AAV2的ITR以及全部或部分AAV2的rep蛋白，只是换上其它血清型AAV的cap蛋白，就可以得到具有各血清型的感染特征的杂合AAV载体。比如rAAV2/1（也有人称rAAV1/2），具有AAV2的ITR和AAV1的外壳，所以感染特性与AAV1一致。这种方法的优点是，第一，可以继续使用为包装AAV2载体构建的带有各种治疗基因和标记基因的载体细胞株，从而大大简化了AAV载体“换壳”的过程；第二，使用研究较清楚且经过临床检验了安全性的AAV2的ITR，可以避免使用其它血清型的ITR可能带来的风险。

    通常AAV病毒颗粒数与受试细胞数的比例大于10⁴v.g.才能检测到外源基因的表达，达到10⁵-10⁶v.g./cell能获得较理想的表达水平。但也并非越高越好。从我们的经验来看，对于AAV2载体肌肉注射剂量范围常为10¹²~10¹³v.g./kg。客户可以此作为参考。通常小鼠肌肉注射的用量为1*10¹⁰~3*10¹¹vg之间，中等剂量是1*10¹¹vg左右。许多研究者选择1~5*10¹³vg来做小动物实验。