454- Roche GS FLX Titanium System
2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了边合成边测序的先河。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。2008年10月,454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件,让GS FLX的通量一下子提高了5倍,准确性和读长也进一步提升。
工作原理:
GS FLX高通量测序是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术,在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下,将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来,通过检测化学发光信号的有无和强度,达到实时检测DNA序列的目的。
工作流程:
1、文库制备:根据样品的种类和实验目的,将基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间,经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA;

2、Emulsion PCR:单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上,每个磁珠结合了一个独立的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化,形成油包水的混合物,每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增,而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后,乳液混合物被打破,扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验;

3、测序反应:携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。PTP孔的直径(29um)确保每个孔只能容纳一个珠子(20um)。然后将PTP板放置在GS FLX中,每个核苷酸依次流入开放的孔洞和DNA捕获磁珠建。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号,并被测序仪CCD照相机所捕获;

4、数据分析:GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长,读取超过4-6亿个碱基信息,通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析,并应用于不同领域。

技术特点:
• 速度快,一个测序反应耗时10个小时,获得100余万个读长和4-6亿个碱基对。
• 测序读长最长,单个序列的读长更长,平均可达到400-500个碱基左右;
• 准确度高,读长超过400bp时,单一读长的准确性可以超过99%;
• 一致性好,测序结果一致性超过99.99%;
• 可以进行Pair-End测序研究;
自从2005年底GS 超高通量基因组测序系统问世以来,已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston,他向454公司提供了自己的血液样本。目前GS系统的用户已在国际科技期刊发表570多篇学术论文,其中在Nature、Science、PNAS等世界顶级的期刊杂志就已发表了60余篇。与GS 20系统相比较,硬件配置和软件系统方面的革新改进,使得GS FLX系统具有了广泛的应用:
应用范围:
1、全基因组测序
多达120 Mb的未知基因组的测序
-生成基因组结构概图
-研究DNA序列的组织,分布和信息
-基因筛查:寻找新基因,定位和功能
-和其他基因组进行比较研究
全基因组进行从头鸟枪法测序,例如微生物基因,BAC和YAC克隆测序。
2、比较基因组研究
-识别单碱基突变
-识别突变热点和保守区域
-识别插入或者缺失的基因
-断定基因型和表型之间的相关关系(比如,研究药物抗性的遗传基础)
-基于基因测序变化进行毒性预测
-进行流行病学分析
-了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础
-进行宏基因组(metagenomics)研究
-古代化石DNA 测序研究
利用配对末端方法(Pair-End Tag)将Contigs拼接成Scaffolds。
3、转录组和基因调节研究
基于短Tags,ESTs, ChIP,或者GIS-PET序列的高通量转录组分析,或者miRNA 序列的基因组范围识别,小分子和非编码RNA的测序。
研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究。
4、扩增产物分析
PCR产物的超精细测序(应用于医学研究的重测序)
-在混合的肿瘤样本中识别体细胞突变
-在群体水平上发现高可信度的SNP位点